HPLC液相色谱保留时间漂移的故障排除

    保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。保留时间漂移的几种常见的原因如下：    

一 色谱柱平衡    如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相*平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。    

流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。    

二 固定相稳定性    固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性达到best。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。    

经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。    

三 色谱柱污染    保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。    

样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。    

避免色谱柱污染简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。    

使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。    

四 流动相组成    流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。    

五 疏水坍塌    当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或*不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters  SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters  Resolve色谱柱）也可避免发生坍塌。

（一）保留时间变化    ①柱温变化--柱恒温    ②等度与梯度间未能充分平衡--至少用10倍柱体积的流动相平衡柱    ③缓冲液容量不够--用>25mmol/L的缓冲液    ④柱污染--每天冲洗柱    ⑤柱内条件变化--稳定进样条件,调节流动相    ⑥柱快达到寿命--采用保护柱

（二）保留时间缩短    

①流速增加--检查泵,重新设定流速      

②样品超载--降低样品量    

③键合相流失--流动相PH值保持在3~7.5;检查柱的方向    

④流动相组成变化--防止流动相蒸发或沉淀    

⑤温度增加--柱恒温

（三） 保留时间延长    

①流速下降--管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡    

②硅胶柱上活性点变化--用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱    

③键合相流失-- 同前（二）3              

④流动相组成变化--同前（二）4    

⑤温度降低--同前（二）5